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ALL SEQ-DNA Protein Interactions(四)

1.PB_seq

蛋白質(zhì)/ DNA結合后跟隨高通量測序

PB_seq是一種DNA結合分析,可以在沒有染色質(zhì)的情況下在全基因組范圍內(nèi)表征DNA蛋白結合能量景觀?(Guertin等,2012)。它屬于通常通過指數(shù)富集(SELEX)系統(tǒng)進化配體的方法家族?(Ozer等,2014)。對基因組DNA進行超聲處理,大小選擇和純化。在與DNA結合蛋白雜交后,分離,提取蛋白質(zhì)結合的DNA并制備用于測序。

好處:

確定與染色質(zhì)結構無關的結合效率

缺點:

尚未被科學界廣泛采用

2.Pu-seq

聚合酶使用測序

Pu-seq提供直接的復制起源位置和效率數(shù)據(jù),以及復制時間的間接估計?(Daigaku等,2015)。

含有雙鏈核糖核苷酸的DNA的堿處理導致磷酸骨架對核糖的裂解3',產(chǎn)生5'羥基末端。如果變性DNA用作隨機六聚體引物延伸的模板,則5ê至3ê合成導致鄰近初始核糖的齊平末端。通過從單鏈DNA產(chǎn)生文庫并在每個末端放置不同的索引引物,可以將測序讀數(shù)定位到單個鏈,以確定具有單堿基準確度的原始核糖核苷酸位置。

好處:

單基準確度

缺點:

僅適用于酵母

3.SELEX or SELEX-seq / HT-SELEX

通過指數(shù)富集的指數(shù)富集/高通量配體系統(tǒng)演化的配體的系統(tǒng)演化

自1990年3個獨立小組描述第一次SELEX實驗時?(Ellington等,1990)?(Tuerk等,1990)(Sullenger等,1990),該方法適用于廣泛的范圍技術?(Chen et al。,2016)?(Takahashi et al。,2016)。為NGS開發(fā)了一種高度多路復用的并行HT-SELEX方法?(Jolma等,2010)。SELEX-seq的變體?(Slattery等,2011)?使用Nextera銜接子序列進行有效的文庫制備?(Zhang等,2016)。

在該方法中,蛋白質(zhì)表達為與pD40htSELEX表達載體中與高斯熒光素酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白結合肽(SBP)的融合體。每個DNA配體含有14bp隨機區(qū)域(14N)和5bp條形碼,其單一地識別單個SELEX樣品。部分嵌套的引物用于連續(xù)的SELEX輪次。將含有所有可能的14bp序列的雙鏈DNA混合物與固定在96孔板的孔中的DNA結合蛋白一起溫育,導致DNA與蛋白質(zhì)結合。洗滌和洗脫后,通過PCR擴增得到的更具特異性序列的群體并測序?(Caroli等,2016)

好處:

高通量和高效率

軟件管道可用?(Hoinka等,2016)(Caroli等,2016)

缺點:

可能包含序列偏差

4.HITS-FLIP

采用熒光配體相互作用分析的高通量測序

HiTS-FLIP是一種在前所未有的深度測量定量蛋白質(zhì)-DNA結合親和力的技術。在該方法中,內(nèi)置于高通量測序儀中的光學器件用于可視化蛋白質(zhì)與流動細胞中測序的DNA的體外結合?(Nutiu等人,2011)。

通過合成對具有錨定的單鏈DNA的微流體流動細胞進行測序。剝離第二鏈DNA并使用Klenow聚合酶和未修飾的dNTP重建以形成雙鏈DNA簇。以不同濃度引入熒光標記的結合蛋白,并對結合進行成像。

好處:

量化和全面

缺點:

需要專門的硬件

尚未被科學界廣泛采用

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