技術(shù)概述
甲基化RNA免疫共沉淀 (methylated RNA Immunoprecipitation，meRIP)基于特異性抗體特異性結(jié)合甲基化修飾的堿基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修飾片段為基礎(chǔ)，然后通過高通量測序，在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究發(fā)生甲基化的RNA區(qū)域，獲得結(jié)果。
目前己被成功的用于檢測全基因組的RNA甲基化的修飾。其主要的實驗原理為，利用免疫共沉淀的方法即用抗RNA甲基化抗體與被隨機打斷的RNA片段進行孵育，pulldown得到有RNA甲基化修飾的片段，并用于后續(xù)核酸檢測。
技術(shù)詳情
數(shù)字標(biāo)簽（UMI）建庫是通過數(shù)字標(biāo)簽追溯每一個文庫片段，準(zhǔn)確還原樣本原始狀態(tài)，實現(xiàn)絕對化、數(shù)字化的精準(zhǔn)定量。UMI建庫方法應(yīng)用于RIP測序，可以降低建庫起始量、解決RIP測序中的堿基偏好性問題、提高input和IP檢測準(zhǔn)確度，將RIP測序準(zhǔn)確度提升到新的高度。
RNA的修飾通常具有選擇性的，因此MeRIP測序文庫堿基平衡性通常不佳，堿基不平衡導(dǎo)致PCR擴增偏好，并影響文庫構(gòu)建和最終的測序分析結(jié)果。UMI正是解決PCR擴增偏好的方法：
利用UMI追溯reads來源和去重
如上圖所示，UMI建庫測序方法在文庫擴增之前為每一條逆轉(zhuǎn)錄的cDNA片段加上唯一的身份標(biāo)簽——UMI，UMI會伴隨片段擴增、測序、分析的全過程。同一個片段經(jīng)過PCR擴增出來的產(chǎn)物均帶有相同的數(shù)字標(biāo)簽，測序完成后利用UMI追溯每一個片段的來源，將相同來源的片段（具有相同的序列和UMI）進行合并，就能準(zhǔn)確去除PCR擴增重復(fù)，一比一準(zhǔn)確還原樣本擴增前的原始狀態(tài)。
UMI避免了PCR擴增偏好性，因此，在建庫起始量較低的情況下，可增加PCR文庫擴增循環(huán)次數(shù)，結(jié)合UMI去重糾錯，在不影響準(zhǔn)確性的前提下使建庫起始量大大降低，20~50ug RNA即可輕松建庫。
m6A修飾普遍存在于mRNA 和多種類型的非編碼RNA，通過影響RNA加工成熟、穩(wěn)定性、mRNA運輸與翻譯、RNA編輯等方面，參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù)和病毒感染等生物學(xué)功能和作用機制的研究。相對于研究較早的DNA和組蛋白表觀修飾，近年來發(fā)現(xiàn)，RNA上也存在類似的調(diào)控機制。RNA修飾超過150種，N6-methyladenosine (m6A)作為最常見的轉(zhuǎn)錄后修飾，介導(dǎo)了超過80%的RNA堿基甲基化。這種甲基化修飾非常普遍，其功能由“編碼器Writer”、“消碼器Eraser”和“讀碼器Reader”介導(dǎo)。
RNA N6‐methyladenosine methyltransferase‐like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2‐dependent posttranscriptional silencing of SOCS2[J].?Hepatology, 2018, 67(6):2254.
Writer即甲基轉(zhuǎn)移酶，在體內(nèi)和體外催化RNA發(fā)生m6A甲基化修飾，包括METTL3、METTL14和WTAP，VIRMA和RBM15可能也算上。Erasers即去甲基化酶，將RNA甲基化修飾信號擦除，包括ALKBH5和FTO。Readers即可識別RNA甲基化修飾的讀碼器，會參與后續(xù)的RNA翻譯、穩(wěn)定性、剪切和轉(zhuǎn)運等過程，包括含YTH結(jié)構(gòu)域的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2。
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rna免疫共沉淀適用rna定位在細胞核的嗎