技術(shù)概述
蛋白質(zhì)因受某些物理或化學(xué)因素的影響，分子的空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)發(fā)生改變并失去原有的生物學(xué)活性的現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的變性作用（denaturation）。變性作用并不引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，而是二級(jí)結(jié)構(gòu)及以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，變性后的蛋白質(zhì)稱(chēng)為變性蛋白。
在變性條件不劇烈，變性蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化不大時(shí)，除去變性因素，在適當(dāng)條件下變性蛋白質(zhì)可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。
但在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，在體外折疊時(shí)，蛋白質(zhì)分子間由于存在大量錯(cuò)誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低。究其原因，蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過(guò)程還受到周?chē)h(huán)境的影響。蛋白質(zhì)復(fù)性實(shí)驗(yàn)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。
基本流程
從破碎細(xì)胞開(kāi)始，然后將細(xì)胞勻漿離心，回收包涵體后，加入變性劑溶解包涵體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再通過(guò)透析等除去變性劑使表達(dá)產(chǎn)物折疊恢復(fù)天然構(gòu)象及活性。
考慮到不同蛋白質(zhì)包涵體的特定結(jié)構(gòu)與理化特性，采用不同的變性變復(fù)性方法。復(fù)性條件包括pH、溫度、蛋白濃度、離子濃度等。復(fù)性輔助劑包括分子伴侶、氧化還原對(duì)等。獲得高品質(zhì)可溶活性蛋白。
技術(shù)詳情
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