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氨基酸測序(N端,C端)
Amino acid sequencing
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技術(shù)待認(rèn)領(lǐng)

技術(shù)概述

氨基酸N端測序:
目前對蛋白N端測序主要分類兩大類,其一為非質(zhì)譜技術(shù),例如經(jīng)典的Edman降解法;其二為質(zhì)譜技術(shù)。

Edman降解法,基本原理包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)或多肽的N-端殘基的偶聯(lián),苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)環(huán)化裂解,和噻唑呤酮苯氨(ATZ)轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三個主要化學(xué)步驟,每個循環(huán)從蛋白質(zhì)或多肽裂解一個氨基酸殘基,同時暴露出新的氨基酸進(jìn)行下一個Edman降解,最后用HPLC法鑒定PTH-氨基酸,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測定。

質(zhì)譜測序原理是將蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切后,直接用串聯(lián)質(zhì)譜測定酶切肽段混合物,然后通過一級質(zhì)譜選擇N端肽段離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析而得到N端序列。能夠?qū)旌系鞍?、末端封閉或糖基化的蛋白質(zhì)進(jìn)行測序。

氨基酸C端測序:
蛋白質(zhì)C端測序3種方法:羧肽酶法、化學(xué)法及串聯(lián)質(zhì)譜法。目前,使用較多的是利用串聯(lián)質(zhì)譜法,其原理為利用蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中會有規(guī)律的破碎,獲得蛋白質(zhì)肽段的碎片,分析圖譜得到蛋白質(zhì)的C-端序列。

羧肽酶是一種從蛋白質(zhì)C端開始逐個釋放氨基酸殘基的外切酶。羧肽酶的原理就是通過檢測羧肽酶逐個釋放氨基酸的順序來判斷蛋白的C端序列,其中釋放氨基酸的檢測有兩種:①色譜法-直接檢測所釋放氨基酸;②質(zhì)譜法-通過測定蛋白或者多肽原分子量和釋放一個氨基酸后分子量差值判斷所釋放氨基酸種類,依次類推。
化學(xué)法指蛋白質(zhì)或多肽與化學(xué)試劑反應(yīng)后,專一性的裂解并檢測C端氨基酸的方法,主要有(異)硫氰酸法和過氟酸酐法。

串聯(lián)質(zhì)譜法是重要檢測工具,不需要借助專用于C端分析的羧肽酶酶切及化學(xué)裂解,僅用最常用的胰蛋白酶酶切,結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜法也能夠測定蛋白的C端序列。

(資料來源:丁香園、高彥飛, 王紅霞)

技術(shù)詳情

(XXX編輯,XXX修善)

參考文獻(xiàn)

高彥飛, 王紅霞. 蛋白質(zhì)及多肽C端測序的研究進(jìn)展[J]. 分析化學(xué), 2007, 35(12):1820-1826.

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