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原核表達(dá)載體構(gòu)建
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責(zé)編：轉(zhuǎn)導(dǎo)生物

技術(shù)概述

在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)是將外源cDNA片段克隆到原核表達(dá)載體上然后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，在原核生物來(lái)表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)[1]，主要包括大腸桿菌表達(dá)、枯草芽孢桿菌表達(dá)、鏈霉素表達(dá)等。原核表達(dá)載體是能攜帶插入外源基因序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的載體。目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體，一般說(shuō)的原核表達(dá)系統(tǒng)主要是指大腸桿菌表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)載體主要有PET系列、PGEX系列和PQE系列。應(yīng)用最多的是PET系列，它能在大腸桿菌中高效且高產(chǎn)的表達(dá)外源蛋白[2]。原核表達(dá)系統(tǒng)主要用途：基因功能研究、重組蛋白特性研究、重組蛋白制備/制藥。

原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌遺傳背景清楚、生長(zhǎng)繁殖快、轉(zhuǎn)化效率高、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、能快速大量生產(chǎn)目的蛋白[3]。原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。[1]

?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

技術(shù)詳情

載體

啟動(dòng)子

報(bào)告基因

抗性

表達(dá)宿主

備注

pET3a

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET3b

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET3c

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET5a

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET5b

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET9a

T7

N-T7

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET11a

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET11b

T7,Lac

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET11c

T7,Lac

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET11d

T7,Lac

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET14b

T7,AmpR,

N-6×His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET15b

AmpR,Lac1

N-6×His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET17b

T7

N-T7

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET19b

AmpR,Lac1

N-His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET20b

T7,AmpR,

C-His,N-pelB

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET21(+)

AmpR,Lac1

C-His,N-pelB

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET21a

AmpR,Lac1

N-T7,C-6×His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET21b

AmpR,Lac1

N-T7,C-6×His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET21c

AmpR,Lac1

N-T7,C-6×His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET21d

T7

N-T7,C-His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET22b

T7,AmpR,Lac1

C-His,N-pelB

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET23(+)

T7

C-His,N-pelB

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET26b

T7

C-6×His

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET28a

T7

N-6×His,N-Thronbin,N-T7,C-6×His

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET28a-Spy

T7

N-Spy,N–6×His,N-Thronbin,N-T7,C–6×His

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET28a-SUMO

T7/Tac

N-6×His,N-Thrombin,,N-SUMO,C-6×His

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET30a

T7

N-6×His,N-Thrombin,N-S,N-EK,C-6×His

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET32a

T7/Tac

N-Thrombin,C-6×His和中間6×His

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET42a

T7/Lac

N-GST,N-S,N-His,N-Thrombin,N-HRV,C-6×His

卡那霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pET16b

T7,Lac

N-10×His, N-Factor Xa

氨芐青霉素

BL21（DE3）等大腸桿菌

/

pTrc-CKS

Trc

N-CKS,C-6×His，N-P3C

氨芐青霉素

BL21(DE3)等大腸桿菌

/

?
?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

載體

啟動(dòng)子

報(bào)告基因

抗性

表達(dá)宿主

備注

pGEX-4T-1

Tac/lac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

BL21等大腸桿菌

可供構(gòu)建

pGEX-6P-1

Tac/lac

N-GST，N-PP/3C

氨芐青霉素

大腸桿菌

可供構(gòu)建

pGEX4T-1-6×His

Tac

N-GST,C-His,N-ttrombin

氨芐青霉素

大腸桿菌

可供構(gòu)建

pGEX-4T-2

Tac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

BL21等大腸桿菌

/

pGEX-4T-3

Tac/lac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

BL21等大腸桿菌

/

pGEX-5X-1

Tac/lac

N-GST，N-Factor Xa

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-6P-2

Tac/lac

N-GST, N-PP/3C

氨芐青霉素

BL21等大腸桿菌

/

pGEX-6P-3

Tac/lac

N-GST, N-PP/3C

氨芐青霉素

BL21等大腸桿菌

/

pGEX-KG

Tac/lac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-5X-3

Tac/lac

N-GST

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-2T

Tac/lac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-1λT EcoRI/BAP

Tac/lac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-5X-2

Tac/lac

N-GST, N-Factor Xa

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-3X

Tac/lac

N-GST,?N-Factor Xa

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-2TK

Tac/lac

N-GST, N-thrombin

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

pGEX-His

Tac/lac

N-GST, C-His

氨芐青霉素

大腸桿菌

/

?
?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

載體

啟動(dòng)子

報(bào)告基因

抗性

表達(dá)宿主

備注

pQE30

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

可供構(gòu)建

pQE40

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

可供構(gòu)建

pQE2

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE9

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE31

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-32

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-70

T5

C-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-80L

T5

N-6×His,Nterm, lacIq

氨芐青霉素

M15

/

pQE-31

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-TriSystem-7

p10

C-8×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-TriSystem-5

p10

C-8×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-TriSystem His-Strep2

p10

HSV,C-8×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-T7-1

T7

N-10×His,C-6×His

卡那霉素

M15

/

pQE-T7

T7

N-6×His,C-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pQE-100 DoubleTaq

T5

N-6×His,Tag-100

氨芐青霉素

M15

/

pQE-82L-Kan

T5

N-6×His

卡那霉素

M15

/

pQE-82L

T5

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pRSET-A

T7

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pRSET-B

T7

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

pRSET-C

T7

N-6×His

氨芐青霉素

M15

/

?
?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

載體

啟動(dòng)子

報(bào)告基因

抗性

表達(dá)宿主

備注

?

pMal-p5X

Tac

N-MBP

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-c5X

Tac

N-MBP

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-c4X

Tac

N-MBP, N-Factor Xa

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-p2X

Tac

N-MBP，N-Factor Xa

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-c2X

Tac

N-MBP, N-Factor Xa

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-c2E

Tac

N-MBP, N-EK

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-p2G

Tac

N-MBP, N-Genenase I

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-p4X

Tac

N-MBP, N-Factor Xa

氨芐青霉素

BL21

/

pMal-p5E

Tac

N-MBP

氨芐青霉素

BL21

/

?
?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

載體

啟動(dòng)子

報(bào)告基因

抗性

誘導(dǎo)方式

備注

pCold I

cspA

N-His, N-Factor Xa

氨芐青霉素

溫度誘導(dǎo)

可供構(gòu)建

pCold-ZZ

CSPA

N-His,?N-Factor?Xa，N-ZZ

氨芐青霉素

溫度誘導(dǎo)

可供構(gòu)建

pCold-Sumo

CSPA

N-SUMO

氨芐青霉素

溫度誘導(dǎo)

可供構(gòu)建

pColdII

CSPA

N-His

氨芐青霉素

溫度誘導(dǎo)

/

pColdIII

CSPA

/

氨芐青霉素

溫度誘導(dǎo)

/

pColdTF

CSPA

N-His,?N-Trigger, N-Thrombin, N-Factor Xa，N-HRV?3C

氨芐青霉素

溫度誘導(dǎo)

/

?
?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

克隆菌株用于擴(kuò)增大量質(zhì)粒，原核載體克隆菌通常是K12系列NovaBlue，JM109及DH5ɑ，這些菌是recA-endA?型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。

表達(dá)菌株是用于表達(dá)蛋白，原核載體表達(dá)菌是帶有染色體T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌，包括所有B型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta 及Tuner，目前BL21（DE3）用得最多的表達(dá)菌。

?
?
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）

參考文獻(xiàn)

1. 陳曉娟等. 蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 30: 142-143.

2. 祁浩等. 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44: 4-6.

3. Mergulha?o FJM et al. Recombinant protein secretion in Escherichia coli [J]. Biotechnology Advances, 2005, 23:177-202.

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  1. 萌蛋萌蛋
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    設(shè)計(jì)原核表達(dá)載體時(shí)，連不上是什么原因

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