技術(shù)概述
蛋白的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究蛋白間相互作用的一種有效技術(shù)手段。轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA 結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由其上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)共同完成的。
以Gal4 系統(tǒng)為例，BD和AD 分別由Gal4 蛋白上不同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-147aa 與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫或研究蛋白間的相互作用時(shí)，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即”誘餌”相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗(yàn)證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨(dú)的BD 可以與GAL4 上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的AD 則不能與GAL UAS 結(jié)合；只有當(dāng)BD 與 AD 分別表達(dá)的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時(shí)，BD 與AD 才能與 GAL UAS結(jié)合并且引起報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游報(bào)告基因，通過這一系列實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證兩個(gè)蛋白之間的相互作用。
技術(shù)詳情
聚生物技術(shù)詞條修善計(jì)劃
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上海-歐易生物
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廣州-伯信生物
北京-寶日醫(yī)（Takara）
如果手上有比較大量的純度比較高的蛋白質(zhì)的話?？梢試L試用以下比較直接的方法：1. isothermal titration calorimetry （ITC），直接測(cè)定兩個(gè)蛋白互相作用的Kd值。2. AUC，也就是超速離心分析?？梢灾苯訙y(cè)定兩個(gè)蛋白相互作用與否。3.SAXS, 也就是X-ray小角散亂。不過技術(shù)難度比較大一些。4. 溶液NMR，這個(gè)應(yīng)該可以但不太了解。5. 結(jié)晶再解構(gòu)，這個(gè)不用解釋了。比較究極一點(diǎn)。6.cryo-EM，同上。比較究級(jí)的方法。7. 最簡(jiǎn)單常用的，gel-filtration，觀察有沒有oligomer的分子量峰出現(xiàn)。但是相互作用弱的話很難觀測(cè)到。8.更簡(jiǎn)單常用的nativePAGE，同上，相互作用弱則很難觀測(cè)到。9.用氨基架橋試劑共價(jià)連接，然后SDS-PAGE。看看有沒有oligomer的帶。暫時(shí)想到這些，跨度比較大。