原創(chuàng)：?Frasergen?菲沙基因

微生物是地球上最古老的生命形式之一，它們體形微小，有些不為我們?nèi)庋鬯l(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)簡單，卻無處不在，盡管很多時候不被我們所注意，但卻非常重要，是整個自然生態(tài)鏈中不可或缺的一部分。高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展及成本的降低，使得微生物研究更加深入和廣泛，研究成果不斷涌現(xiàn)于各大期刊雜志，包含Science、Nature、Cell等國際頂尖學(xué)術(shù)期刊。

如何選擇不同的微生物宏組學(xué)解決方案？

基于高通量測序研究微生物宏組學(xué)的解決方案：擴增子測序、宏基因組測序、宏轉(zhuǎn)錄組測序，那么如何根據(jù)研究目的選擇不同的宏組學(xué)解決方案呢？

?如果我們想知道環(huán)境中存在哪些微生物？每種微生物的豐度情況如何？

答：擴增子測序（16S/18S/ITS可變區(qū)擴增子、全長16S/18S/ITS）

?如果我們不僅想知道環(huán)境中存在哪些微生物，還想知道微生物有哪些功能？

答：二代宏基因組測序、三代宏基因組測序

?如果我們進一步想知道這些環(huán)境微生物正在行使什么功能？

答：宏轉(zhuǎn)錄組測序

擴增子測序

擴增子測序是對特定長度的PCR產(chǎn)物或者捕獲片段進行測序，16S、18S、ITS rDNA 被認為是最適于細菌、真核微生物、真菌系統(tǒng)分類鑒定的指標。

 

宏基因組?(Metagenome)

以環(huán)境中全部細菌、真菌、古菌等的基因組遺傳物質(zhì)DNA為研究對象，進行de novo組裝，以基因為研究單元，進行物種多樣性、基因結(jié)構(gòu)、差異基因和功能基因等的研究。

環(huán)境微生物應(yīng)用領(lǐng)域

宏組學(xué)測序適用于各種自然環(huán)境及人或動物微生態(tài)的研究，下面讓我們來看看它的運用領(lǐng)域：

常見樣本類型

宏組學(xué)的應(yīng)用非常廣泛，涉及各種各樣的環(huán)境類型，土壤、水體、污泥、食品發(fā)酵液、小鼠腸道、反芻動物瘤胃等；人腸道微生物的研究中，宏組學(xué)的運用也非常的廣泛，涉及各種各樣的樣本類型，胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、糞便等。

參考文獻

1.????Ni J, Shen T C D, Chen E Z, et al. A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn’s disease[J]. Science Translational Medicine, 2017, 9(416): eaah6888.

2.????Wilck N, Matus M G, Kearney S M, et al. Salt-responsive gut commensal modulates T H 17 axis and disease[J]. Nature, 2017, 551(7682): 585.

3.????Thompson L R, Sanders J G, McDonald D, et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity[J]. Nature, 2017.

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16S與宏基因組的區(qū)別

 

16S rDNA測序及宏基因組測序都是研究微生物的重要方法，那么這兩者到底有什么區(qū)別呢？什么情況下選擇16S測序？什么情況下選擇做宏基因組測序？

測序原理不同

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rDNA的DNA序列，具有高度的保守性。該序列具有10個保守區(qū)域和9個可變區(qū)域（V1-V9），其中保守區(qū)域在細菌間差異不大，高可變區(qū)具有屬或種的特異性。

16S rDNA的結(jié)構(gòu)

對16S rDNA某個高可變區(qū)進行測序，用于研究環(huán)境微生物中細菌或古菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性。通過對某一段高變區(qū)序列（V4區(qū)或V3-V4區(qū)）進行PCR擴增后進行測序，得到1500bp左右的序列。

16S的測序原理

宏基因組測序則是將微生物基因組DNA隨機打斷成350bp的小片段，然后在片段兩端加入通用引物進行PCR擴增測序，再通過組裝的方式，將小片段拼接成較長的序列。

宏基因組測序原理

 

研究內(nèi)容不同

16S測序主要研究群落的物種組成、物種間的進化關(guān)系以及群落的多樣性；宏基因組測序在16S測序分析的基礎(chǔ)上還可以進行基因和功能層面的深入研究：

	16S	宏基因組??
物種組成??	√ ?	√
物種豐度	√	√
基因預(yù)測??	X	√
功能注釋??	X	√
代謝通路??	X	√
功能分析??	X	√

 

鑒定到的物種及深度不同

??在界水平上，宏基因組有細菌、古菌、真菌和病毒的信息，而16S只有細菌和古菌的信息。

??在種水平上，宏基因組測得的物種種類高于16S，是因為16S這一測序技術(shù)的限制，鑒定到種水平的很少。

??在門、綱、目、科、屬水平上，宏基因組測得的物種種類沒有16S多，因為16S選的是某一可變區(qū)，可測到低豐度的物種的種類遠遠多于宏基因組，因此16S測得的物種種類在門、綱、目、科、屬分類水平上更豐富。

??對于16S測序而言，任何一個高變區(qū)或幾個高變區(qū)，盡管具有很高的特異性，但是某些物種（尤其是分類水平較低的種水平）在這些高變區(qū)可能非常相近，能夠區(qū)分它們的特異性片段可能不在擴增區(qū)域內(nèi)。

??宏基因組測序通過對微生物基因組隨機打斷，并通過組裝將小片段拼接成較長的序列。因此，在物種鑒定過程中，宏基因組測序具有較高的優(yōu)勢。

 

研究重點不同

16S研究側(cè)重于解答群落結(jié)構(gòu)，而宏基因組測序則側(cè)重于解答菌落的功能。

一句話總結(jié)：宏基因組測序研究是16S測序分析的升華與補充。

研究微生物群落結(jié)構(gòu)的組成差異及特征，選擇16S測序；研究微生物的群落結(jié)構(gòu)、物種分類、基因功能及代謝網(wǎng)絡(luò)，選擇宏基因組測序；當然我們還可以采用16S與宏基因組測序聯(lián)合的研究思路，即大樣本量進行16S測序，根據(jù)差異物種，選部分代表樣品進行宏基因組測序。

全長16S rDNA測序

 

16S rDNA長度大約為1500bp左右，三代平臺的PacBio Sequel的平均讀長為8-12Kb，因此結(jié)合該平臺可以成功測序獲得16S/18S的全長序列，全長序列信息不僅能提高物種鑒定的分辨率，還能提高樣本中微生物組成鑒定的精確度，從而能更加真實的還原樣本中微生物的群落結(jié)構(gòu)。

全長16S產(chǎn)品優(yōu)勢

高通量--能同時分析群落中所有的微生物

高數(shù)據(jù)質(zhì)量--采用PacBio的CCS模式，對序列自我矯正，數(shù)據(jù)一致性準確率高

高分辨率--分析16SrDNA全長，分類精準到種。

	二代擴增子	三代全長擴增子
樣本要求	無嚴格樣品要求，只要能擴出相應(yīng)片段
擴增區(qū)域	1-2個高變區(qū)，如16S的V4/V5	全長序列
測序平臺	Illumina?MiSeq/HiSeq	PacBio?Sequel
測序數(shù)據(jù)量	≥30,000?Tags	≥?5,000?CCS
分析內(nèi)容	微生物群落組成與豐度
結(jié)果準確性	一般	準確度高
成本	低	較高

 

經(jīng)典案例分析^[1]

樣品來源：模擬菌群（已知單菌混合）和湖水樣本

測序策略：PacBio RSII（FL-16S，PhyloTags）

Illumina MiSeq（16S-V4區(qū)，V4 iTags）

分析思路：

①模擬菌群驗證PhyloTags準確性；

②湖水菌群樣本PhyloTags和V4 iTags比較

③ PhyloTags提高菌群分辨率的原因解析

（1）模擬群落驗證SMRT測序

研究人員使用含有23個細菌參考基因組的模擬群落得到一系列PacBio 16s rRNA基因序列數(shù)據(jù)，并將SMRT技術(shù)產(chǎn)生的全長 16s rRNA基因序列稱為PhyloTags。5個模擬群落的高質(zhì)量PhyloTags數(shù)據(jù)成功分成22個OTU，每個OTU的16s rRNA基因相似度高于97%。通過質(zhì)量分選出來的質(zhì)量最好的PhyloTag對模擬基因組16s rRNA基因的相似度是99.5%。另外，5個PhyloTag技術(shù)重復(fù)的相關(guān)性非常好，相互之間的相關(guān)系數(shù)均達到96%以上，并且與鳥槍法打斷的meta序列具有很強相關(guān)性。在模擬群落實驗中，PhyloTags的結(jié)果可以與傳統(tǒng)iTag測序結(jié)果相媲美。

 

（2）Sakinaw湖水菌群分析

Sakinaw湖含有豐富的微生物類群，研究人員選取8個不同深度的湖水進行采樣，分別對這些樣本進行PhyloTag和V4 iTag分析。結(jié)果表明，V4 iTags數(shù)據(jù)中有0.2-4.1%的微生物在門水平上無法區(qū)分，而PhyloTags則能在門水平上將這些微生物完全區(qū)分。比較各個深度的PhyloTag和V4 iTag數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)深度在50-120m時，兩者在門水平上的微生物分類差異明顯。在環(huán)境樣本中，短讀長測序數(shù)據(jù)在復(fù)雜群類區(qū)分中失去優(yōu)勢，而PhyloTags則能在屬水平上對菌群進行區(qū)分。

（3）PhyloTags提高菌群進化分類的分辨率

為了評估擴增子長度對群體分析的影響，研究人員隨機抽取了Sakinaw樣本中的1818條PacBio FL序列和它們對應(yīng)的二代測序產(chǎn)生的V4區(qū)域序列進行成組比較。結(jié)果表明，在多個實例中相同的序列對表現(xiàn)出來不同的鑒定結(jié)果，產(chǎn)生這些結(jié)果的原因是16s rRNA基因的突變位點分布并不均勻，高估或低估這些突變都將影響微生物群落的分類。

綜上所述，PacBio全長16S rDNA測序可提供更準確的物種分類和更多的物種鑒定，在系統(tǒng)發(fā)育、群落鑒定和代謝通路預(yù)測方面都更有優(yōu)勢。

 

參考文獻：

1.Singer E, Bushnell B,Coleman-Derr D, et al. High-resolution phylogenetic microbial community profiling[J]. The ISME journal(2016).

 

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